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提取液体样品/病毒核酸(RNA或DNA)为何很难？

阅读次数：783   发布时间：2020/7/23 15:42:35

 提取液体样品/病毒核酸(RNA或DNA)为何很难？
原因一是量少。病毒颗粒中的RNA或DNA是作为遗传物质保存，每个病毒*多只携带几个拷贝(而一个细胞中有上万种RNA分子，每种RNA有很多拷贝)，同时其长度也十分有限(一般不到细胞基因组的万分)，样品中病毒数往往又不是很多，使得样品中病毒核酸的绝对量往往比一个细胞中核酸的绝对量还少，所以操作中十分容易丢失。另外，由于得到的核酸绝对量很少，不能使用电泳和测OD检测，只能通过PCR或RT-PCR检测，而PCR或RT-PCR的条件又需要优化，所以要确定提取是否成功十分不容易。
如果有N个样品，标记N+2个1.5～2mL螺旋盖塑料离心管，多出的一个为阳性对照，一个为阴性对照。为避免污染，建议不要使用压盖式塑料离心管。在每个管上做个标记，以在后续操作时区别向心面和离心面。然后各加入0.2mL液体样品(血清、血浆、尿液、脑脊液、唾液、眼泪等等)。不同样品处理方法如下：
 
① 如果是口腔拭子、咽喉拭子等各种拭子样品，则将拭子放入0.2mL自备生理盐水中挤压出液体，然后取0.2mL进行提取。
② 如果是粪便等半固定样品，则取约0.3mL的样品，加入0.3mL自备生理盐水，震荡重悬，离心取0.2mL上清进行提取。
③ 如果血液，细胞培养液等含细胞的液体，可以离心用上清，也可以直接取用，但后者提取的RNA中有细胞的基因组DNA污染。血浆的抗凝剂必须是EDTA或ACD，不能是肝素。使用ACD时由于所加入ACD会增加体积，样品会被稀释，得到的病毒滴度会比使用EDTA低15%左右。血浆按0.6mL/管的量分装保存，以避免反复冻融。
④ 如果样品是实体组织或培养细胞，则需要在自备生理盐水中匀浆后离心，用0.2mL上清液(含病毒)进行提取，但此种情况下*后得到的RNA不可避免的会含有基因组DNA污染。
⑤ 如果液体样品中的病毒需要富集，可以使用1.5mL上述方法得到的液体在4℃条件下24,000g冷冻离心60分钟，移弃1.3mL、用剩下的0.2mL继续操作。

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